Attualmente, dopo l’introduzione della Legge 40, è di fatto vietata ogni forma di diagnosi genetica che avvenga dopo la fecondazione dell’ovocita (cioè dopo la penetrazione dello spermatozoo) sia che questa venga effettuata in maniera molto precoce sul 1° e 2° corpo polare (Figura 1) sia che questa venga effettuata in maniera più tardiva (PGD), prelevando direttamente le cellule embrionarie (blastomeri) in 3a giornata di coltura (Figura 2) od in 5° giornata di coltura quando l’embrione raggiunge lo stadio di Blastocisti (Figura 3). Occorre precisare che anche se alcune sentenze dei Tribunali Amministrativi Regionali hanno accolto il ricorso effettuato da medici specialisti ed associazioni di pazienti sulla illegittimità del divieto della diagnosi pre-impianto il quesito è stato di fatto rimandato alla Corte Costituzionale alla quale spetterà la sentenza finale.

Figura 1	Figura 2	Figura 3

Al momento pertanto l’unica tecnica possibile è la diagnosi genetica effettuata sul 1° corpo polare (1 PB) dell’ovocita o diagnosi genetica di pre-concepimento (PCGD).

Si tratta di una nuova procedura che mira a selezionare gli ovociti in cui non sia presente l’anomalia genetica di cui il partner femminile della coppia è portatore in modo da produrre solo embrioni sani(Figura 4). Il prelievo del corpo polare viene eseguito attraverso l’impiego di un sofisticato sistema di micromanipolazione che permette di operare direttamente sulle cellule in esame sotto controllo microscopico. Una sottile micropipetta di vetro con i margini arrotondati viene inserita nell’involucro che circonda l’ovocita (Zona Pellucida) attraverso una fessura creata da un fascio di luce operata da un sistema laser. Mediante una delicata aspirazione, si preleva il globulo polare dall’ovocita. (Video).

Figura 4	Video PCGD

In questa maniera la diagnosi genetica viene eseguita sull’ovocita prima del concepimento (penetrazione dello spermatozoo all’interno dell’ovocita) e non sullo zigote o sull’embrione. Con la diagnosi di pre-concepimento, a differenza della PGD, si esclude a priori la possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche.

Il corpo polare è una minuscola cellula che non ha nessun ruolo biologico, in quanto degenera dopo alcune ore dalla sua formazione (Figura 5). Esso possiede però un assetto genetico speculare a quello dell’ovocita, per cui se il 1 PB presenta la mutazione materna ne consegue che l’ovocita risulterà privo della mutazione e quindi normale. Viceversa se il 1 PB non presenta la mutazione materna sarà l’ovocita a mantenere quella mutazione (Figure 4 e 6). Attraverso l’analisi del 1 PB possono pertanto essere fecondati con gli spermatozoi paterni mediante fecondazione in vitro (ICSI) solo gli ovociti privi del difetto genetico. La letteratura scientifica ha dimostrato che la rimozione del 1 PB non ha nessun effetto negativo sul successivo sviluppo embrionale.

Figura 5	Figura 6

Nel protocollo di diagnosi genetica dell’ovocita mediante analisi del 1 PB, i tempi da osservare sono strettissimi (al massimo 6 ore). Per questo motivo, l’applicazione della tecnica segue uno schema articolato che richiede una stretta coordinazione tra due diverse equipe:

• Il team del laboratorio di PMA;
• Il team del laboratorio di genetica.

L’attività di questi due gruppi di professionisti consente di ottenere i risultati entro 6 ore dal prelievo degli ovociti.

La diagnosi pre-concepimento può essere applicata a coppie portatrici di malattie monogeniche a trasmissione:

• autosomica recessiva (Fibrosi Cistica, Beta Talassemia, SMA, etc.)
• legata al cromosoma X (Sindrome X-Fragile, Distrofia Muscolare DMB/DMD, etc.)
• autosomica dominante di origine femminile (Distrofia Miotonica, Neurofibromatosi Rene policistico, ecc).

Con questa procedura non possono essere individuate eventuali malattie genetiche a trasmissione autosomica dominante di origine maschile.

L’applicazione della diagnosi preconcepimento in questo caso specifico si basa sul presupposto teorico che circa il 50% degli ovociti dopo i 35 anni di età presenta alterazioni del numero dei cromosomi. Pertanto lo scopo della diagnosi preconcepimento sarebbe quello di selezionare gli ovociti migliori dal punto di vista della qualità genetica con il fine di ottenere embrioni con migliore capacità di impianto e minore tasso di aborto (Ferraretti et al 2006). I limiti di questa applicazione specifica sono che l’analisi delle anuploidie cromosomiche soltanto sul primo corpo polare permette di individuare esclusivamente gli errori genetici collegati alla prima divisione meiotica e non quelli derivanti dalla seconda divisione meiotica o dalla fertilizzazione o della prima mitosi (Gianaroli et al.2007; Figura 7).

Figura 7

L’analisi è effettuata su materiale esterno all’embrione che non ha alcun ruolo biologico.

La biopsia del 1 PB non incide sullo sviluppo dell’embrione, mantenendo inalterate le relative percentuali di impianto.

La diagnosi genetica viene quindi eseguita sull’ovocita e quindi l’embrione non viene manipolato. Ciò previene la formazione e la successiva eliminazione degli embrioni malati e consente di superare i problemi etici che hanno determinato il divieto della diagnosi pre-impianto.

Utile per quelle coppie portatrici di malattie genetiche che non vogliono affrontare la scelta dolorosa di un’interruzione volontaria della gravidanza.

L’analisi genetica in questo caso consente di ottenere solo informazioni relative ad anomalie di origine femminile e quindi inapplicabili in caso di malattie genetiche autosomiche dominanti e quelle di natura cromosomica di origine maschile. Inoltre una bassa risposta alla stimolazione ovarica incide sul numero di ovociti disponibili per l’analisi genetica. Una buona riserva ovarica è quindi un requisito importante per il successo della procedura. Inoltre su un certo numero di ovociti (dipendente dal tipo specifico di malattie genetica presente) non sarà possibile effettuare la diagnosi di esclusione della malattia e pertanto non potranno essere fecondati perché in essi è presente il fenomeno della ricombinazione. Questo consiste nello scambio di porzioni cromosomiche che avviene regolarmente tra cromosomi omologhi durante la prima divisione meiotica (crossing-over). Se la ricombinazione coinvolge la regione cromosomica contenente il gene causa della malattia l’ovocita tratterrà una copia normale del gene ed una contenente la mutazione materna. Su questi ovociti solo l’analisi del secondo corpo polare potrebbe escludere con certezza la malattia, però questa procedura non è attuabile in Italia perché è effettuata dopo la fecondazione (Figura 8). Attualmente il Centro di Medicina della Riproduzione dell’European Hospital di Roma è l’unico centro in Italia ad avere ottenuto tre gravidanze su malattie monogeniche (Beta Talassemia, X Fragile, Charcot Marie Tooth) con questa tecnica.

Figura 8

La diagnosi preconcepimento (PCGD) viene fatta in collaborazione con il Centro Genoma (www.laboratoriogenoma.eu).